该成果以“Optimization of the Brewing Process and Analysis of Antioxidant Activity and Flavor of Elderberry Wine”为题发表于Fermentation（中科院二区，IF 5.123）杂志，文章第一作者为2020级硕士研究生曹桦强，通讯作者为张彭湃副教授。

Introduction

果酒具有很高的营养价值和适口性。但用单一品种水果酿制的果酒，口感、风味和营养价值不够丰富。因此，以多种水果品种为原料酿造的果酒亟待开发。本研究以苹果、荔枝、梨、蓝莓、接骨木为原料，探索混合果汁水果酒酒的生产工艺。我们采用单因素试验和响应面法(RSM)对发酵工艺进行优化，结果表明:料液比为1:7.5，酵母接种量为0.68 g/L，发酵温度为20℃，添加糖量为120 g/L。在此工艺条件下，在35L发酵罐中进行了验证试验。结果表明，接骨木酒的酒精含量、残糖含量、总酸度、总酚含量和总黄酮含量分别为7.73%vol、8.32 g/L、9.78 g/L、8.73mg /mL和1.6 mg /mL。从接骨木果酒中鉴定出33种挥发性成分。接骨木果酒酒体均匀透澈，口感适宜，酒香与果香和谐，感官评价得分为95分。抗氧化活性实验表明，接骨木酒具有一定的抗氧化能力，并且经发酵的接骨木的抗氧化能力明显高于未经发酵接骨木。

Methods

实验前，我们根据初步实验确定四种水果的风味、色泽、酸度、糖分、口感等因素，结合多因素分析，得到苹果、梨、荔枝、蓝莓混合物的最佳体积比为6:2:2:1。按比例将它们充分混合，然后倒入容器中。之后加入一定量的水稀释，并使用蔗糖调至合适的糖度，最后加入用蒸馏水稀释至5 g/L接骨木提取物。采用巴氏杀菌法对发酵原料进行消毒，然后将发酵原料加入500ml的玻璃发酵瓶中。用5倍以上35℃左右的蒸馏水活化干酵母15-30分钟。按适当比例加入活化酵母并调至合适的发酵温度，开始发酵。主发酵期约为18天，后发酵为3℃(20天)。然后对酒精含量、总残糖、总酸、感官评价等相关指标进行测定和分析。

Results and Analysis

我们根据单因素结果分析（图1），以料液比、酵母添加量、发酵温度为变量，感官评分和酒精度为响应值，进行了响应面实验优化。

Figure 1. The results of the single-factor test.

（1）感官评分模型

感官评分的模型结果显示，当第三个主要因素在三维曲面和二维等高线图中固定在一定水平时，三个主要因素中的两个因素对感官评分有相互影响 (图2) 。模型项A、B、C、AB、BC、A²、B²和C²表现是显著的 (P<0.05) ，并受到正向影响。但是其他项AC是不显著的 (P>0.05) ，受到了负面影响。可以解释为，这三个测试因素，对果酒的味道和口感的影响很大。

通过对各主要因素的影响及各主要因素的F值的分析，可以得出这些因素的影响力为：酵母接种量>发酵温度>料液比。此外，二次响应三维曲面图（图2）可以清楚地说明水果类型、发酵工艺和发酵条件是决定葡萄酒感官特性复杂性的主要因素。如图2(A-C)所示，随着接种量和发酵温度的增加，感官评分先降低后升高，且变化明显。发酵温度能直接影响接骨木果酒的香气特征。在发酵过程中，提高温度可以提高酵母的生长速度、发酵速率和细胞活力，从而导致不良气味和杂醇醇的产生。相反，温度降低，影响了酵母的生长和发酵速率，影响了发酵产物的组成。同样地，当酵母添加量过多时，发酵速度会过度加快，对酒的风味和口感产生不利影响。反过来，发酵受到抑制，导致发酵后不成熟。由图2(a-c)可知，在二维等高线上，椭圆等高线和圆形等高线分别显示了各两个因素之间的相互作用显著或不显著。在料液比与发酵温度的交互作用中，发酵温度与酵母接种量的交互作用是显著的，而料液比与发酵温度的交互作用不显著。

Figure 2. Response surface and contour plots for sensory score. (A, a. Effect of solid–liquid ratio and yeast inoculum. B, b. Effect of solid–liquid ratio and fermentation temperature. C, c. Effect of yeast inoculum and fermentation temperature).

（2）酒精度模型

通过模型拟合，酒精含量的回归模型中，各因素交互作用的三维视图和二维等高线图如图3所示。其中A、B、C、AB、AC、A²、B²、C²的交互作用显著 (p<0.05)。而BC的交互作用对果酒中的酒精产量没有显著性。

从图3(A-C)可以看出，酒精度随着酵母接种浓度和发酵温度的升高而迅速增加。原因可能如下：酵母细胞的繁殖依赖于温度。较适宜的温度可以改变酵母代谢的适宜环境，从而增加酵母的数量。当温度逐渐降低时，酵母的生长受到强烈抑制，从而降低发酵效率。或者，如果酵母接种量低，酒精的产量也会降低。同时，大的料液比例意味着在酒精发酵中有较高的糖度，这可能会过度的产生酒精度。相反，随着固液比的降低，发酵产生的酒精也会逐渐减少。从图3(a-c)可以看出。等高线呈椭圆形，说明三个因素中任意两个相互作用均显著。我们也可以在等高线图中最小的椭圆中得到最优的预测值。

Figure 3. Response surface and contour plots for alcohol content. (A, a. Effect of solid–liquid ratio and yeast inoculum. B, b. Effect of solid–liquid ratio and fermentation temperature. C, c. Effect of yeast inoculum and fermentation temperature).

（3）优化条件的验证

根据我们之前的实验，优化目标应该是高的感官评分和适宜的酒精。由于其负面的感官特性，酒精是优化的限制因素。所以，当我们考虑预测时，感官评分的预测值设为最大值，但酒精度范围的预测值设为6.86 ~ 7.66。

优化的发酵条件下，在35L发酵罐中进行验证试验。理化指标如表5所示。

Table 5. Physical and chemical index

与发酵前和发酵后的指标相比，总酚和总黄酮的含量显著增加，说明经过发酵的接骨木中活性物质得到释放。这些结果可以解释为，发酵引起了接骨木中酚类糖苷物质的去糖基化作用。另外，生物质的酶解也是发酵中的关键步骤，它将酚类和类黄酮物质降解为简单的小分子。这对提高接骨木果酒的品质具有重要意义。

（4）风味物质分析

我们共鉴定出33种挥发性化合物，其中酯类17种，醇类6种，酸类2种，其他类8种。醇类、酯类和萜类化合物是造成接骨木酒风味的主要成分。如表6所示。

Table 6. Aroma components in elderberry wine.

（5）抗氧化能力分析

我们分别对接骨木果酒的DPPH、ABTS+和O2自由基的能力进行了实验，如图所示6, 7 和 8所示。表明接骨木果酒具有较好的抗氧化活性。

Figure 6, 7 and 8

Results

在这项研究中，用苹果、梨、蓝莓、荔枝和接骨木浆果制备了一种新型果酒。在单因素实验结果的基础上，利用响应面法进一步优化了料液比、酵母接种量和发酵温度三个因素。该模型能较好地预测和解释接骨木果酒的感官评价和酒精含量的结果。优化结果表明，最佳发酵条件为料液比1:7.5，酵母接种量为0.68 g/L，发酵温度为20℃。在此条件下，选择35L发酵罐进行验证试验。最终得到的产品有显著的果香味，包含有苹果香、梨香味、荔枝香，并带有淡淡的鲜草味，香气和谐；其口感清爽且细腻，富含水果的甜和蓝莓的酸。优化后，采用GC-MS对酒样的挥发性成分进行分析，结果显示了33种风味成分。测定总抗氧化活性。实验结果表明，其清除DPPH、ABTS+和O²自由基的能力明显，但经过发酵后，其抗氧化能力显著提高。该研究表明，以水果浓缩汁为原料确定的最佳工艺条件进行发酵是可行的，能够生产出令人满意的、具有特色风味的高质量果酒。